Al morir su madre, Carlos V reinó sobre España por derecho propio y no ya en nombre de la reina Juana. Pero ese reinado duró menos de un año, pues en 1556, movido por los remordimientos que jamás dejaron de perturbar su sensible corazón y abrumado por el peso de tantas responsabilidades, abdicó, legando la corona del imperio a su hermano Fernando I, rey de Bohemia, y la corona del reino de España y los Países Bajos a su hijo primogénito, Felipe II. El día de la abdicación vestía de luto y lucía sobre su pecho, como único brillo, el Toisón de Oro.
Vistiendo luto permanente y cubriendo de paños negros las paredes de los aposentos, se retiró al monasterio de San Jerónimo en Yuste, en la provincia de Cáceres, región de Extremadura. En sus últimos años narran que el señor de ambos hemisferios era aquejado de la gota y apenas se movía de sus modestos aposentos. Acompañaba con frecuencia a los monjes en el coro y en el refectorio, pescaba en un reducido estanque y su mesa seguía estando tan bien provista de viandas como siempre.
Aquel convento, construido en 1402 por los Jerónimos, contaba con una comunidad de treinta y ocho monjes, además de una gran iglesia, con un sencillo y austero palacio que albergó los últimos dos años de vida del emperador. Allí le siguieron dos de sus hermanas, Leonor y María, al quedar viudas. Tenía una servidumbre compuesta de cincuenta personas.
Carlos I ordenó fuera construido el mausoleo de Juana y de Felipe en la Capilla Real de la catedral de Granada, junto a los de sus abuelos, Isabel y Fernando. El inmenso le cho de sus tumbas fue esculpido en blanco mármol de Carrara por Bartolomé Ordóñez, siendo esta la última obra del escultor.
Es notable destacar que a pesar de tantas y tan prolongadas separaciones circunstanciales, los hijos de Juana I de Castilla y de Felipe de Habsburgo permanecieron siempre muy unidos. De los seis hijos de Juana y Felipe descendieron doce reyes de la cristiandad. En el imperio, España, Italia, Portugal, Francia, Hungría, Inglaterra, Polonia y Dinamarca las dinastías procedían de Juana directamente o por matrimonios con descendientes de la infortunada reina.
El retiro de Carlos V duró hasta el día de su muerte, acaecida a las dos de la madrugada del 21 de septiembre de1558. Su aguda percepción del tiempo hizo que muriera rodeado de atlas, brújulas y relojes. El emperador expiró con los ojos fijos en el último cuadro de Tiziano, su pintor favorito, realizado en 1554. Este último retrato mostraba a Carlos con los rasgos de «un pobre pecador». En la bóveda celeste resplandecía la Trinidad: el Padre, el Hijo y bajo la forma de paloma, el Espíritu Santo, cuadro que fue llamado «La Gloria» y representaba, en efecto, el triunfo dela trilogía divina, con la Virgen María junto a Dios, en calidad de Mediadora. Más abajo, aparecía Moisés con las tablas de la ley y Noé, que sostenía un modelo en miniatura del arca. En el ángulo derecho, el emperador Carlos V, arrodillado y vestido con sudario, imploraba la gracia divina para él y los suyos.
Sus funerales, a los que según la leyenda quiso asistir en vida, han sido objeto de frecuentes alusiones. Es muy posible que, con sentido arrepentimiento, pasara el resto de sus días en un ambiente impregnado de misticismo, penitencia y oración. Con frecuencia, desde aquel monasterio de los Jerónimos, dictaba su voluntad a su hijo y sucesor, Felipe II, a quien no transmitió en herencia el Imperio alemán, por juzgar que este no tenía la suficiente flexibilidad para afrontar la responsabilidad de dirigir un territorio escindido por el drama religioso.
Dudó también en concederle los Países Bajos, pero Felipe los reclamó juzgando ya con un criterio post-renacentista, que la supremacía política no se encontraba en Italia sino en el centro de Europa, cuya clave podía ser aquel país.
Aunque aparentemente la monarquía hispana de Felipe II retrocedió en extensión con respecto al Imperio de Carlos V, lo cierto es que la aumentó, ya que aparte de los nuevos territorios colonizados en América y Asia por los españoles se incorporó a ella el reino de Portugal y su vasto Imperio colonial, en la misma América, en África y en Asia, completando así la unidad ibérica soñada por los últimos Trastámara, reinantes en Castilla y Aragón.